Преодоление проблем синтеза железа

Ученые разрабатывают эффективный протокол бесклеточного синтеза сложных белков железа и серы в одном горшке

Токийский технологический институт

изображение: На этой диаграмме показаны два основных этапа предлагаемого протокола синтеза. Шаг 1 показывает химический каскад, используемый для создания бескислородной среды, а также систему PURE, используемую для синтеза «незрелых» (апо) белков. Шаг 2 демонстрирует реализацию механизма SUF, который добавляет кластер [4Fe-4S] к апо-белкам, получая функциональные и зрелые белки [4Fe-4S].посмотреть больше

Фото: Воспроизведено из Wang и Nishikawa et al. 2023 ACS Синтетическая биология

Кластеры Fe-S, входящие в состав белков Fe-S, встречаются у всех форм жизни. Они играют важную роль в качестве биологических кофакторов — молекул-помощников, которые помогают этим белкам в различных биохимических преобразованиях, — которые участвуют в дыхании и обмене веществ. Эти кластеры представляют большой исследовательский интерес, поскольку считаются важной частью эволюции. Они служат связующим звеном между пребиотической химией (химическими процессами, существовавшими до появления форм жизни) и сложными молекулярными и биологическими системами, которые мы знаем сегодня. Проще говоря, они могли быть одним из примитивных катализаторов, приведших к возникновению жизни на Земле. Таким образом, мы надеемся, что наличие удобных методов синтеза белков Fe-S продвинет наше понимание биологии молодой Земли и поможет нам ответить на главный вопрос о происхождении жизни.

Однако, несмотря на их распространенность, синтез зрелых белков Fe–S вне клетки оказался сложной задачей. Они не только требуют сложного клеточного механизма для синтеза, но также легко разлагаются при контакте с кислородом из-за его реакции с их кластерами Fe-S. Поэтому ученые были вынуждены пойти по сложному пути: сначала получить и извлечь неполный (или «апо») белок с последующим его созреванием (добавлением кофактора Fe-S) в условиях строгого отсутствия кислорода. Но что еще больше усложняет этот процесс, так это наличие в конечном экстракте примесей железосодержащих белков.

В недавнем исследовании группа исследователей, в том числе доценты Косуке Фудзисима и Шон МакГлинн из Института наук о жизни на Земле (ELSI), Токийского технологического института и доцент По-Сян Ван из Национального центрального университета, разработали новый протокол для производство зрелых белков [4Fe-4S], в которых кластер Fe-S расположен внутри кубической структуры. Команда разработала специализированный путь сборки белковой системы Fe-S, который будет функционировать в бескислородной среде благодаря наличию системы поглощения кислорода для доставки зрелых белков Fe-S.

Исследователи сначала попытались собрать так называемую систему образования серы (SUF). У бактерий эта мультибелковая система содержит все необходимые механизмы для производства кластеров [4Fe-4S]. Он имеет более высокую толерантность к кислороду по сравнению с другими путями с аналогичными функциями (такими как азотфиксация и кластерная система ихон-сера). Исследовательская группа создала рекомбинантный путь SUF, состоящий из шести белковых субъединиц и способный функционировать в бесклеточной среде.

Чтобы поддерживать бескислородную среду внутри пробирки, исследователи затем ввели трехферментный каскад (набор из трех ферментативных реакций, которые происходят последовательно), который служит системой поглощения кислорода. Хотя эта система очистки удаляет кислород из окружающей среды, она также повышает эффективность системы. Это достигается за счет производства восстановленного флавинадениндинуклеотида (FADH2), носителя электронов, который необходим для синтеза кластера Fe-S системой SUF.

Наконец, для синтеза белка апо команда применила специализированный бесклеточный метод, который позволяет производить белки in vitro с использованием синтеза восстановленных бесклеточных белков, известного как система PURE. С добавлением генетического материала (ДНК или мРНК) и необходимых источников энергии система PURE по сути действует как фабрика искусственного белка.